Фенольный гидрофобный препарат прополиса

 

Гепатозащитная активность

Поражения печени преимущественно характеризуются нарушением целостности мембран гепатоцитов, последнее чаще всего связано с активизацией процессов липопероксидации в этих мембранах. В связи с этим, изучение гепатозащитной и антиоксидантной активности гидрофобного препарата прополиса (в лекарственной форме – таблетки), а также препарата сравнения – отечественного гепатопротектора – таблеток “Силибор” проводили одновременно в условиях введения животным прооксиданта и модельного гепатотоксина – тетрахлорметана, в дозе 1 мл/100 г 50% масляного раствора внутрижелудочно. Через час после введения, на фоне развивающегося поражения печени животным вводили гидрофобный препарат прополиса и “Силибор”. Через 24 часа на высоте патологического процесса, вызванного ядом, определяли в сыворотке крови аланинаминотрансферазу, индикаторный фермент, являющийся наиболее надежным показателем цитолиза гепатоцитов, в гомогенате печени определяли один из конечных продуктов липопероксидации – малоновый диальдегид. Выявлено, что фенольный гидрофобный препарат прополиса проявляет гепатозащитную и антиоксидантную активность при острых поражениях печени на 10,5% и в 2,5-4 раза выше соответственно, чем препарат сравнения “Силибор” (в одинаковых дозах).

Интоксикация тетрахлорметаном является классической моделью повреждения субклеточных мембран. Экспериментальное поражение печени тетрахлорметаном сопровождается повреждением мембран эндоплазматического ретикулума, митохондрий и плазматических мембран гепатоцитов с нарушением каталитических свойств мембраносвязанных ферментных комплексов. В основе молекулярных механизмов повреждения мембран гепатоцитов тетрахлорметаном основная роль принадлежит продуктам его биотрансформации в мембранах эндоплазматического ретикулума. Последнее происходит при участии цитохромов Р-448 и Р-450, осуществляющих метаболизм данного ксенобиотика с образованием мембранотоксических продуктов свободно-радикальной природы. Повреждение мембран гепатоцитов приводит к нарушению функционирования ферментных и неферментных систем перекисного окисления липидов, что сопровождается нарушением структуры мембраны, угнетением синтеза белка, гиперферментомией. Течение отравления при однократном введении тетрахлорметана – острое.

На этой модели было изучено гепатозащитное действие гидрофобного препарата прополиса и “Силибора” в условиях их предварительного (за 2 часа) введения. Тетрахлорметан вводили внутрижелудочно в дозе 1 мл/100 г 50% масляного раствора. Через 24 часа отмечались гиперферментемия аланинаминотрансферазы, аспартатами­нотрансферазы и уменьшение скорости секреции желчи, а также выделение с ней холатов. Особенно значительное изменение отмечалось со стороны антитоксической и выделительной функций, что согласуется с механизмом повреждающего действия тетрахлорметана.

Гидрофобный препарат прополиса вводили белым крысам внутрижелудочно в дозе 10 мг/кг, а “Силибор” – в дозе 25 мг/кг за 2 часа до введения гепатотоксина.

Предварительное введение гидрофобного препарата прополиса предотвращает развитие выраженных изменений, характерных для поражения тетрахлорметаном. Наи­более показательным является почти полная нормализация продуктов липопероксидации в ткани печени. Гидрофобный препарат прополиса препятствует возникновению цепной реакции в результате метаболизма четыреххлористого углерода. При этом в гомогенате печени определяется 0,71±0,05 мкмоль/г диеновых конъюгатов (ДК) – вдвое меньше, чем у нелеченных животных (1,56±0,04), что свидетельствует об уменьшении образования гидроперекисей, уменьшено также накопление малонового диальдегида до 68±3,1 против 105,6±4,8 мкмоль/г.

Тем не менее, устранение повышенной липопероксидации не способствует полной нормализации функционального состояния печени. В частности, проявляется холестатическое действие тетрахлорметана: активность щелочной фосфатазы (ЩФ) составляет 277,5±9,8 ед.л против 205±9,8 – у интактных крыс, концентрация холатов в жел­чи не превышает 13,37±0,7 г/л против 16,4±0,5 г/л – в контроле. Нормализуется содержание выделенного с желчью билирубина, что свидетельствует об уменьшении гемолитических процессов под влиянием тетрахлорметана. Длительность гексеналового сна уменьшается почти вдвое по сравнению с нелеченными животными (55,7±2,6 против 98±5,9 мин). Это указывает на большую сохранность ферментов эндоплазматической сети, тем не менее этот показатель в 4,5 раза больший, чем у интактных крыс.

О выделительной функции печени судили по длительности выделения бромсульфалеина с желчью, установлено, что время выведения у леченных гидрофобным препаратом прополиса животных значительно уменьшается, но контрольных величин не достигает. Подобные изменения характеризуют и содержание гликогена в печени.

Наиболее характерным для процесса цитолиза гепатоцитов является увеличение активности аспартатаминотрансферазы (АСТ) и особенно аланинаминотрансферазы (АЛТ). В наших опытах гидрофобный препарат прополиса способствовал уменьшению гиперферментемии этих индикаторных ферментов. В частности, активность АСТ составила 1,16 ммоль, ч.л против 1,67±0,06 у нелеченных животных, АЛТ – 1,60±0,04 против 2,04±0,01 ммоль, ч.л. У интактных крыс активность АСТ составила 1,11±0,06, а АЛТ – 1,16±0,06 ммоль, ч.л. Исходя из того, что активность АЛТ наиболее полно отражает функциональное состояние печени, по этому показателю была определена эффективная доза гепатозащитного действия изучаемого препарата. Если в предыдущих опытах с введением гидрофобного препарата прополиса через час после введения тетрахлорметана на фоне развившегося поражения печени, вызванного гепатотоксином, активность этого фермента уменьшилась на 30%, после введения гидрофобного препарата прополиса в концентрации 10 мг/кг (ЕД30), то в условиях предварительного введения той же дозы – 10 мг/кг гиперферментемия уменьшилась по АЛТ на 50%. Следовательно, 10 мг/кг гидрофобного препарата прополиса является ЕД50 в случае профилактического применения и ЕД30 – при лечении уже развившихся поражений.

Для препарата сравнения – отечественного гепатопротектора “Силибора” такая же степень влияния его на гиперферментемию характерна при использовании в дозе 25 мг/кг. Следовательно, активность фенольного гидрофобного препарата прополиса по антицитолитическому эффекту в 2,5 раза превышает активность “Силибора”.

Комбинация туберкулостатических препаратов рифампицина и изониазида, обладая хорошей противомикробной активностью, проявляет выраженную гепатотоксичность. В литературе имеются данные о холестатическом влиянии этой комбинации, обусловленной способностью изониазида вызывать гиперплазию и пролиферацию желчных ходов.

Рифампицин вводили в дозе 50 мг/кг, изониазид – 100 мг/кг внутрижелудочно ежедневно в течение 14 дней. Одновременно группе животных вводили гидрофобный препарат прополиса в дозе 10 мг/кг, второй группе – “Си­либор” по 25 мг/кг. Результаты исследования показали, что у леченных гидрофобным препаратом прополиса животных статистически достоверно уменьшилась степень гиперферментации по сравнению с животными, леченными “Силибором”, в том числе активность ЩФ снизилась до нормальных величин, АЛТ на 83%, АСТ – на 23% больше, чем у интактных крыс. Тем не менее, активность АЛТ была на 164% меньше, чем у животных, леченных “Силибором”, и в 2 раза меньше, чем у нелеченных животных. На 80% увеличилось содержание гликогена в печени крыс, получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса, по сравнению с леченными “Силибором”. У этих животных практически нормализовалась длительность гексеналового сна, скорость выведения бромсульфалеина с желчью и содержание в желчи основных ее компонентов – холатов, билирубина и холестерина. Для большинства этих показателей разница между группами, леченными гидрофобным препаратом прополиса и “Си­либором”, статистически достоверна.

Таким образом, фенольный гидрофобный препарат прополиса обладает гепатозащитной активностью при поражении печени туберкулостатическими препаратами рифампицином и изониазидом, этот эффект достоверно более выражен, чем у препарата сравнения “Силибора”.

 

Противовоспалительная активность

Бронхиальная астма. Для изучения действия препарата заранее готовились животные (кролики весом 3,5-4,0 кг) с подельным специфическим заболеванием, для чего использовалась методика (Д.С.Саркисов, П.И.Ремезов, 1960), а также морские свинки весом 200-400 г.

Клинико-анатомический комплекс симптомов, напоминающих бронхиальную астму человека, получали у животных путем их сенсибилизации и последующего ингаляционного введения разрешающей дозы антигена.

Сенсибилизация животных соответственно проводилась яичным белком: трехкратные подкожные инъекции 2-4 мл и 0,2-0,4 мл 25% взвеси яичного белка в физиологическом растворе с 3-4 дневными промежутками, а через 14-30 дней они помещались в камеру, где подвергались воздействию такими же взвесями белка, распыленной в виде тумана. Через 10-15 минут животные проявляли признаки беспокойства, появлялась резкая экспираторная одышка, сухой кашель. Спустя сутки в легких выслушивалось много сухих, а затем влажных хрипов.

Животные с указанными поражениями подвергались лечению 1% препаратом прополиса методом ингаляции в специальной камере. Время – до 10 минут. Ингаляции – 2-3 раза в сутки. Курс лечения до 10 дней.

На основании наблюдений установлено, что препарат прополиса оказывает положительное действие на течение бронхолегочного процесса (уменьшались, а затем полностью исчезали катаральные явления, кашель, нормализовалась температура).

После курса лечения животные забивались и подвергались общему патоморфологическому исследованию с гистологическим изучением внутренних органов.

Тонзиллит. Для получения модельного заболевания использовалась методика Э.Л.Листенгартена (1953). Культура гемолитического стрептококка, выделенного из зева людей, больных ангиной, вводилась молодым кроликам (6-7 месяцев) с помощью шприца в слизистую зева в области миндалин после предварительного охлаждения конечностей (погружение конечностей в воду при температуре от 0 до +1°С на 30 минут). Животные после этих манипуляций отказывались от пищи, у них повышалась температура тела, значительно увеличивались миндалины.

Фенольный гидрофобный препарат прополиса применяли в течение 10 дней. Препарат с помощью прилагаемого распылителя распыляли в течение 1-2 секунд. Орошение производили 2-3 раза в день.

Этот же способ лечения использовали и при явлениях стоматита.

Стоматит. В данном опыте использовали также кроликов весом 2,0-3,5 кг. Стоматит получали у животных с помощью формалина в сочетании с термическим ожогом слизистой рта (Л.М.Рабинович, 1936). Слизистая рта обрабатывалась раствором формалина 37% концентрации в течение 15-20 минут. Затем, после перерыва в 30 минут, полость рта обрабатывалась в течение 30 секунд горячей водой. Образуется язвенно-некротический стоматит. Вызванное модельное заболевание подвергалось лечению в условиях, которые описаны выше.

Животные в последних двух случаях также забивались и подвергались общему патоморфологическому исследованию с гистологическим изучением внутренних органов, а также обрабатывались результаты морфологического и биохимического анализа крови животных до и после применения препарата у здоровых животных при внутривенном введении в течение 20 дней.

Наблюдения при лечении тонзиллитов и стоматитов: исчезала гиперемия зева, отечность передних дужек, значительно уменьшалась разрыхленность и отечность миндалин, снижались явления интоксикации. После 7-8 ингаляций процесс начинал купироваться и полностью исчезал после применения фенольного гидрофобного препарата прополиса до 10 дней.

Таким образом, предлагаемый препарат прополиса является биологически безвредным, терапевтически активным – обладает противовоспалительным свойством.

Проктит. Исследования были проведены на 21 белой крысе обоего пола массой тела 160-200 граммов.

Экспериментальный проктит у крыс вызывали двукратным введением в ректум 40% пенного аэрозоля формалина в дозе 0,5 мл/кг.

Наблюдения над животными и исследование показателей периферической крови, температуры ректума, массы тела проводили на 3, 7, 11, 16 и 21 сутки после воспроизведения модели экспериментального проктита.

На 21-е сутки опыта животных усыпляли хлороформом и производили их вскрытие, которое показало, что состояние внутренних органов 3-й и 4-й групп животных удовлетворительное, тогда как в группе нелеченных животных было отмечено вздутие, метеоризм, непроходимость кишечника. В этой же группе нелеченных животных при иссечении ректума как визуально, так и гистологически выявлено резкое воспаление слизистой с гнойными бляшками, кровоточащими язвами и свищами, с явлениями аугезивного перитонита и преобладанием гематогенных элементов в клеточном инфильтрате.

В группе животных, леченных препаратом “Бетиол” при светооптическом изучении материала прямой кишки, обнаружено преимущественно хроническое воспаление с наличием эпителизированных язв, некоторые из них с признаками метаплазии в многослойный эпителий. Отчетливо был заметен исход продуктивного воспаления с развитием молодой соединительной ткани в подслизистом слое с локальным распространением на наружные отделы кишки.

Значительно лучше выглядели ректумы в группе животных, леченных фенольным гидрофобным препаратом прополиса. Их слизистые были ровного бледно-розового цвета без каких либо кровоизлияний и их следов. В двух случаях из шести отмечены следы зарубцевавшихся язв.

Гистологические исследования также отражали нормальное строение без особых патологических изменений.

Таким образом, на основании проведенных исследований было установлено, что фенольный гидрофобный препарат прополиса (в форме – суппозитории) способствует протеканию проктита в более легкой форме, чем у крыс, леченных препаратом “Бетиол”, и, тем более, в группе нелеченных животных.

Значения большинства изучаемых показателей у животных восстанавливались в более короткий период, чем во второй группе. Кроме того, лечение фенольным гидрофобным препаратом прополиса полностью предохраняло животных от гибели.

Противовоспалительная активность фенольного гидрофобного препарата прополиса была изучена также на белых беспородных крысах обоего пола, массой тела 140-170 граммов.

Отек задней конечности животных вызывали введением в стопу 0,08 мл 2,5% водной взвеси аэросила.

Препарат наносили в виде аппликации на правую заднюю лапу до введения флогогена и спустя 45 минут в дозах 0,05; 0,10; 0,15; 0,20 грамма, который равномерно был распределен в твердом жире (тип А). Через 24 часа с помощью механического онпометра определяли величину отека правой задней конечности крыс контрольной и опытной групп. Левая задняя лапа у всех животных служила контролем.

Наибольший процент угнетения отека наблюдался под влиянием фенольного гидрофобного препарата прополиса в дозе 0,1 грамма и составил 26,3%. При нанесении препарата в дозах 0,05; 0,15 и 0,20 грамма отек задней конечности уменьшался соответственно на 15,8%, 10,5%, 6,8% (рис. 62).

Выявленная зависимость “доза-эффект” коррелирует с результатами ранее проведенных биофармацевтических исследований методами “in vitro”, где максимальное высвобождение действующих веществ субстанции из основы твердый жир (тип А) наблюдалось в дозе 0,1 г.

 

Противолучевая активность

Проблема лечения лучевых дерматитов и язвенно-некротических поражений кожи, а также слизистых оболочек, возникающих в экстремальных условиях при воздействии смешанного гамма-нейтронного излучения, а также бета- и гамма-излуче­ния радиоактивных осколочных продуктов, а в мирное время преимущественно в условиях лучевой терапии злокачественных новообразований и в разнообразных аварийных ситуациях, остается чрезвычайно актуальной и ждущей своего разрешения проблемой радиобиологии и медицинской радиологии, несмотря на использование с лечебной целью многочисленных и разнообразных лекарственных средств.

В литературе есть указания на эффективность прополиса при дерматитах лучевого генеза. Это подтвердили и наши экспериментальные исследования, проведенные в 1976-1977 г.

Испытанию были подвергнуты три фракции, выделенные из прополиса: фенольная гидрофильная, фенольная гидрофобная и смоло-бальзамическая, содержащая в своем составе группу конденсированных фенольных соединений сходного состава.

В работе использована ранее многократно испытанная модель локального лучевого поражения кожных покровов. В эксперименте на крысах-самцах весом 130-150 г лучевому воздействию на аппарате РУМ-7 (40 кв, 20 мА, 0,6 мм Аl, 7,5 см, тубус 30 мм, мощность дозы 1980 р/мин, доза 5000 рад) подвергался оттянутый кожный лоскут на правом боку животного таким образом, что внутренние органы животного оставались вне поля облучения. Через 16-20 суток на месте лучевого воздействия наблюдалась эпиляция шерстного покрова и развивался влажный дерматит в пределах поля облучения. Далее эрозивная (язвенная) поверхность под многократно отторгающимся струпом подвергалась медленному заживлению с эпителизацией и последующим отрастанием шерстного покрова.

С момента развития у всех облученных животных локальных проявлений лучевого поражения, т.е. с 20 суток после воздействия радиации, средняя продолжительность эпителизации облученного участка кожи составила, по нашим данным, 38,5±2,0 суток (табл. 55). Начало отрастания шерстного покрова отмечено в среднем через 59±3,5 суток, а завершалось отрастание шерсти через 82±2,5 суток.

Таблица 55

Влияние фракций прополиса на заживление кожных повреждений после локального лучевого воздействия (5000 рад)

Лечебное
воздействие
Коли­чество животных Заверше­ние эпителизации (сут) Начало отраста­ния шерсти (сут) Окончание отрастания шерсти (сут)
20 38,5±2,0 59±3,5 82±2,5
Фенольная гидро­фильная фракция 20 39,0±2,5 57±4,0 78±3,0
Фенольная гидро­фобная фракция 20 14,3±2,0 17,0±2,7 37,0±3,0
Достоверность отличия от контроля t
p
8,6
<0,001
9,5
<0,001
11,5
<0,001
Смоло-бальзами­ческая фракция 20 15,5±2,0 18,5±3,0 33,0±2,5
Достоверность отличия от контроля t
p
8,3
<0,001
8,8
<0,001
14,0
<0,001

Лечение местных лучевых повреждений кожи крыс начиналось с 20-х суток после лучевого воздействия в дозе 5000 рад. На локально облученный участок кожи крыс с развившимся влажным дерматитом и эрозией кожных покровов один раз в сутки (5 раз в неделю) наносилась 1% мазь, приготовленная на безводном ланолине. В качестве действующего начала использовались препараты одной из упомянутых фракций прополиса. Длительность лечения – три недели (21 сутки, 15 аппликаций).

Установлено (табл. 55), что применение 1% мази с фенольным гидрофильным препаратом прополиса в качестве действующего начала не оказало практически никакого влияния на скорость заживления местных лучевых поражений кожи. Однако этот отрицательный результат, по нашему мнению, все же не означает, что гидрофильную фракцию прополиса следует рассматривать как простой балласт. Весьма вероятно, что она обладает выраженной биологической активностью по другим показателям. Не исключено также, что при иных способах введения (например, при парентеральном) она может стимулировать заживление опосредованно, через механизмы неспецифической иммунореактивности организма.

Применение мази, в которой в качестве действующих начал использованы гидрофобная и смоло-бальзами­ческая фракции прополиса, дало в тех же экспериментальных условиях весьма выраженный и практически совпадающий эффект (табл. 55). Препараты обеих фракций эпителизацию области лучевого поражения стимулировали весьма эффективно, ускоряя ее завершение в 2,5 раза. Отрастание шерсти начиналось и завершалось также в 2,5-3,0 раза быстрее, чем в контроле.

Таким образом, противолучевая эффективность про­полиса, его способность стимулировать заживление кожных ран связана главным образом с фенольной гидрофоб­ной и конденсированной смоло-бальзамической фракция­ми этого комплекса. Эффект этих компонентов прополиса выше, чем суммарного препарата, не уступает лечебной эффективности наиболее оправдавших себя на практике лечебных средств (масло облепихи, этоний, галаскорбин, метацил) или даже ее превосходит.

 

Антимикробная активность

Для проведения микробиологических исследований фенольного гидрофобного препарата прополиса, полученного из различных образцов прополиса, применяли метод серийных разведений с использованием в качестве растворителя спирта. В качестве питательной среды применяли аминопептид с рН=7,3, предварительно разбавленный водой очищенной (1:2). Изучаемые культуры помещали в пробирку из расчета 200000 микробных тел на 1 мл среды.

Результаты антимикробной активности фенольного гидрофобного препарата прополиса анализировали через 20 часов после того, как образцы культур были внесены в термостат при температуре +37°С. Среды с культурой кислотоустойчивого сапрофита В5 термостатировали не менее 3-х суток (в связи с медленным ростом исследуемого объекта).

Результаты исследований (табл. 56) показали, что антимикробная активность фенольного гидрофобного препарата прополиса более выражена, чем прополиса-сырца, что, очевидно, можно объяснить преобладанием у исходного продукта адсорбционных свойств восковых и смолобальзамических веществ над процессами десорбции действующих соединений. Наша гипотеза согласуется с данными литературы в отношении сырьевого источника.

Таблица 56

Антимикробная активность спиртовых растворов гидрофобной фенольной фракции различных образцов прополиса (мкг/мл)

Культура микроорганизмов
Область сбора
прополиса
Стафи­лококк золотистый 209 Р Кишеч­ная па­лочка Антра­коид (споро­носная палоч­ка) Кисло­тоусто-йчивый сапрофит В5 Канди­да альбиканс
Алжир

Бангладеш

Белгородская обл.

Белоруссия

Болгария

Винницкая обл.

Волгоградская обл.

Германия

Днепропетровская обл.

Донецкая обл.

Житомирская обл.

Запорожская обл.

Ивановская обл.

Киевская обл.

Киргизия

Кировоградская обл.

Краснодарский край

Красноярский край

Крым

Курская обл.

>30

15

>30

>30

30

15

>30

30

30

15

15

30

30

>30

<15

30

15

15

30

30

<1000

500

500

500

1000

500

500

500

1000

1000

500

500

500

500

500

1000

1000

1000

1000

1000

>125

250

125

250

250

125

125

>250

125

125

250

125

125

250

>250

125

250

125

250

250

30

<30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

30

<30

30

30

<60

<60

60

60

60

60

60

<60

60

60

60

60

60

60

>60

60

60

60

60

60

Продолжение табл. 56

1 2 3 4 5 6
Латвия

Липецкая обл.

Литва

Московская обл.

Одесская обл.

Полтавская обл.

Ростовская обл.

Тамбовская обл.

Узбекистан

Франция (1974 г.)

Франция (1975 г.)

Хабаровский край

Харьковская обл.

Херсонская обл.

Хмельницкая обл.

Черкасская обл.

Черниговская обл.

Черновицкая обл.

Эстония

Ярославская обл.

30

>15

30

>30

30

30

>30

15

>15

15

15

15

<30

30

15

15

>30

30

15

15

500

1000

500

>500

500

1000

500

1000

1000

500

1000

500

1000

500

<1000

500

1000

500

<1000

<1000

125

250

125

>250

250

125

250

125

<125

250

125

125

250

125

250

125

250

125

>250

>250

30

>30

>30

<30

30

30

30

30

>30

30

30

30

<30

30

>30

<30

<30

>30

30

30

60

>60

<60

>60

60

60

60

60

<60

60

60

60

60

>60

60

60

>60

60

60

60

 

Анализируя полученные результаты с точки зрения теоретического обоснования зависимости степени биологической активности исследуемых образцов от их химического состава, нами установлено, что наиболее выраженное антимикробное действие фенольного гидрофобного препарата прополиса в сравнении с прополисом-сырцом объясняется отсутствием в первом восков и наличие в его составе более высокого содержания как в качественном, так и в количественном отношении флавонов и флавонолов.

Следовательно, фенольный гидрофобный препарат прополиса проявляет более выраженный антимикробный эффект и имеет определенные преимущества в фармацевтической технологии по сравнению с исходным сырьем, что и было использовано нами при разработке технологии рациональных лекарственных форм на его основе.

 

Токсикологическая характеристика

Острая и хроническая токсичность. Острую токсичность фенольного гидрофобного препарата прополиса определяли при внутрижелудочном введении его на белых крысах и мышах.

С этой целью 2 группам белых мышей массой 18-20 г (по 10 животных в группе) вводили 2 дозы изучаемого препарата. 1-я группа животных получала 2000 мг/кг,
2-я – 4000 мг/кг. Большее количество препарата ввести не удалось в связи с ограниченным объемом жидкости, вводимой в желудок мыши, – до 1 мл.

В опытах на белых крысах максимальное количество препарата, которое могло быть введено при однократном введении составило 2500 мг/кг. При введении дробными дозами – с интервалом 3 часа было возможным  ввести 7500 мг/кг.

Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток. Гибель животных отмечали в течение 48 часов после последнего введения изучаемого вещества. Поведение погибающих животных характеризовалось адинамией, вялостью, отказом от пищи.

Полученные результаты позволили рассчитать ЛД50 препарата (ЛД50 = 6875 мг/кг).

Таким образом, фенольный гидрофобный препарат прополиса относится к практически не токсичным веществам.

Хроническую токсичность фенольного гидрофобного препарата прополиса определяли на 80 белых беспородных крысах обоего пола (40 самцов и 40 самок).

Самцы и самки были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой. Первая группа животных служила контролем; второй группе препарат вводили в дозе 2,5 ЕД50 – то есть в 2,5 раза превышающей условно-терапевтическую дозу; третьей группе животных вводили дозу препарата, превышающую условно-терапевтическую в 10 раз; четвертой – 25 ЕД50. Последнюю дозу вводили в течение 6 месяцев, остальные – 12 месяцев.

В течение всего времени исследования гибели животных не было.

Масса тела как контрольных, так и опытных животных возрастала, причем увеличение массы по сравнению с исходом и у интактных крыс, и у животных, получавших разные дозы препарата, статистически не различалось. Показатели массы тела животных в течение длительного (12 месяцев) времени свидетельствовали об отсутствии выраженного токсического влияния фенольного гидрофобного препарата прополиса. Чувствительность самцов и самок к действию препарата была одинаковой.

У самцов и самок, получавших препарат в разных дозах, дыхательная функция не нарушалась, частота дыхания находилась в тех же пределах, что и у контрольных животных. Также отсутствовали изменения в температуре тела опытных и контрольных животных, как у самцов, так и у самок.

При изучении поведенческой реакции по методу “открытое поле” отмечено, что активность контрольных животных к концу опыта уменьшалась. Уменьшение двигательной активности можно объяснить тем, что неоднократное помещение крыс в одну и ту же обстановку, в которой животные не испытывают болевых ощущений, ведет к выработке условнорефлекторного поведения без лишнего возбуждения. Эмоциональность животных, показателями которой являются физиологические отправления, в течение опыта изменениям подвержена не была. Разницы между показателями центральной нервной системы у самцов и самок обнаружено не было.

О деятельности сердечно-сосудистой системы судили на основании анализа электрокардиографического исследования. Этот метод достаточно информативен, способен уловить многие изменения в проводящей системе сердца, оценить сократительную функцию миокарда, коронарный кровоток, функцию автоматизма. Благодаря этому кардиография нашла широкое применение в оценке токсических влияний на сердце.

Анализ данных ЭКГ показал, что во всех группах животных, получавших различные дозы препарата, достоверных изменений частоты сердечных сокращений, интервалов и амплитуды зубцов не было. Ритм во всех случаях был синусовый, сократительная способность миокарда предсердий и желудочков нормальная, коронарный кровоток не нарушен, изменений в проводящей системе не было.

При длительном введении фенольного гидрофобного препарата прополиса самцам и самкам крыс, изменений со стороны красной крови не наблюдали. Количество эритроцитов и у контрольных, и у опытных животных находилось в пределах нормы и статистически достоверно не отличалось у животных, длительно получавших препарат, от исходных показателей этих же групп. Разница показателей у самцов и самок отсутствовала.

Содержание гемоглобина в крови крыс, получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса также не отличалось от показателя контрольных животных и исходных величин. Время свертывания крови у всех опытных животных находилось в пределах физиологических и сезонных норм.

Содержание лейкоцитов в крови крыс в течение всего времени наблюдения проявляло тенденцию к уменьшению. Тем не менее, статистически значимые различия между этими показателями у животных, получавших изу­чаемый препарат, и контрольных животных, а также между показателями исхода у опытных групп выявлены не были.

Лейкоцитарная формула у крыс всех групп и во все сроки была в пределах нормы и не различалась у интактных и опытных животных. Биохимический состав крови опытных животных соответствовал сезонным нормам, контрольным данным и показателям исхода.

Учитывая то, что печень является одним из важнейших органов, принимающих участие в метаболизме лекарственных средств и ядов, изучали ее антитоксическую функцию по продолжительности гексеналового сна у крыс контрольной группы и при введении фенольного гидрофобного препарата прополиса. Этот тест свидетельствует об активности фермента уридиндифосфатглюкуронилтрансферазы, являющегося ключевым ферментом процесса глюкуронизации.

Результаты исследований показали, что продолжительность гексеналового сна у крыс в течение опыта была подвержена сезонным изменениям. Так, в мае и августе длительность сна была уменьшена, что согласуется с данными литературы об индукции ферментов эндоплазматической сети в весеннее и летнее время. Тем не менее, под влиянием гидрофобного препарата прополиса у самок наблюдалась тенденция к укорочению гексеналового сна, а у самцов – дозозависимое, статистически достоверное уменьшение времени сна. Эти данные свидетельствуют о способности фенольного гидрофобного препарата прополиса вызывать индукцию ферментов эндоплазматической сети, причем действие более выражено у самцов.

Активность индикаторных ферментов сыворотки крови, свидетельствующих о процессах цитолиза в гепатоцитах – трансаминаз АлАТ и АсАТ в течение всего времени наблюдения находилась в пределах нормальных величин. Статистически достоверные различия между опытными и контрольными животными выявлены не были, что свидетельствует об отсутствии некротических изменений в печени, миокарде и скелетных мышцах животных, длительно получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса.

При изучении функции почек отмечено, что диурез у крыс в течение опыта не изменялся. Согласно методике определения диуреза, количество выделенной животными мочи пересчитывали на 100 г массы.

Белок в моче экспериментальных животных не превышал 5 мг/мл, что соответствует физиологическим нормам. Кетоновые тела и билирубин в моче отсутствовали. Сахар и уробилиноген были в пределах нормы. При микроскопии мочевых осадков крыс контрольной группы и животных, получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса, обнаруживали элементы, встречающиеся в моче при нормальной функции почек: плоский эпителий – немного, эпителий мочевого пузыря – местами, лейкоциты – единичные в поле зрения.

После окончания опыта животных забивали путем декапитации. При внешнем осмотре было обнаружено, что наружные покровы не изменены.

При вскрытии полости черепа было установлено, что оболочки головного мозга не изменены, граница между серым и белым веществом выражена. При вскрытии грудной и брюшной полостей посторонние запахи отсутствовали.

Сердце было макроскопически однородно, деструкций и зон ишемии не обнаруживали. Ткань легких была серо-розового цвета, экссудат в плевральной полости не выявлен. Печень была полнокровная, селезенка не увеличена. Слизистая желудочно-кишечного тракта была без кровоизлияний и изъязвлений, надпочечники не увеличены. Органы половой системы – семенники, яичники, матка, – были обычных размеров без видимых признаков патологии. Массовые коэффициенты всех внутренних органов находились в пределах нормы.

Для микроскопического исследования были взяты печень, почки, сердце, легкие, надпочечники, половые железы, желудок, кишечник. Препараты окрашивали гематоксилин-эозином.

При микроскопическом исследовании легких было установлено, что у контрольных и опытных животных воздушность ткани хорошо выражена, альвеолы ткани разделены альвеолярными септами, рисунок ткани сохранен. Местами наблюдалась десквамация эпителия в просвете мелких и крупных бронхов. Клетки миокарда имели четкую структуру, ровную окраску. Состояние сосудов сердца было без патологических изменений. Структура печени была сохранена во всех препаратах. Гепатоциты и балочная структура органа находилась без изменений. Ядерного и клеточного полиморфизма не наблюдалось.

При микроскопическом исследовании почек была отмечена нормальная структура органа, четко выраженное деление на мозговой и корковый слой. Эпителий канальцев был без изменений. Структура клубочков сохранялась.

Селезенка имела обычное строение. В красной пульпе наблюдались различные клеточные элементы с преобладанием эритроцитов.

Надпочечники по своей гистоструктуре и соотношению зон коры не отличались друг от друга во всех группах. Клетки мозгового слоя были без особенностей. Отмечали умеренное полнокровие органа.

Половые железы. Ткань семенников у животных контрольной и опытных групп была без изменений. В яичниках определялись яйцевые фолликулы различной степени зрелости, имелись вторичные фолликулы.

Строение желудка и кишечника было обычное, без признаков патологических изменений. Брюшина (парие­тальный и висцеральный листки) – не изменена.

Таким образом, данные патоморфологических исследований подтвердили данные физиологических и биохимических методов определения хронической токсичности фенольного гидрофобного препарата прополиса и позволяют считать этот препарат практически нетоксичным.

Все опытные животные вполне удовлетворительно переносили применение фенольного гидрофобного препарата прополиса в дозах, в 2,5 и 10 раз превышающие условно-терапевтические, в течение 12 месяцев и в дозе
25 ЕД50 – 6 месяцев. По внешнему виду, поведению, приему пищи опытные животные не отличались от животных контрольной группы. Показатели центральной нервной системы, дыхания, сердечно-сосудистой системы, крови, печени, почек были в пределах нормы и не отличались от таковых у контрольных животных. Наблюдалась небольшая индукция ферментов эндоплазматического ретикулума печени, что может способствовать выведению токсических ксенобиотиков из организма.

Исследование хронической токсичности проводили на половозрелых кроликах породы Шиншилла со средней массой 2300 г. В опыте использовалось 14 кроликов. Животные были разделены на 2 группы. Первая группа служила контролем, животные второй группы ежедневно получали фенольный гидрофобный препарат прополиса в дозе 100 мг/кг – 10 ЕД50.

На протяжении всего эксперимента (6 месяцев) состояние животных оставалось хорошим, они были активны, сохраняли хороший аппетит, прибавляли в массе, причем опытные животные прибавляли в массе не меньше, чем контрольные.

Температура тела у опытных и контрольных животных была в пределах нормальных величин. Частота дыхания в опыте не отличалась от показателей контрольных кроликов. Артериальное давление, измеренное на цент­ральной артерии уха кролика по методу Гранта-Ротшиль­да, статистически достоверно не различалось в опыте и контроле.

Показатели ЭКГ свидетельствовали о том, что сократительная способность и проводящая система сердца опытных животных не отличалась от контрольных.

Морфологические показатели крови кроликов (ко­личество эритроцитов, лейкоцитов, а также лейкоцитарная формула) свидетельствовали об отсутствии токсического поражения кроветворной системы. Время свертывания крови кроликов было в пределах физиологической нормы, содержание гемоглобина в крови не уменьшалось.

Изучение влияния фенольного гидрофобного препарата прополиса на биохимические показатели кроликов выявило отсутствие его токсического действия на поджелудочную железу (уровень глюкозы в крови находился в пределах нормы) и печень (содержание общего белка и мочевины не уменьшалось, а липидов – не увеличивалось).

Об отсутствии токсического влияния фенольного гидрофобного препарата прополиса на печень свидетельствовало также то, что активность трансаминаз печени – АлАТ и АсАТ не повышалась у опытных животных, также не было увеличения содержания в их крови билирубина, а бромсульфалеин, введенный в вену в дозе 5 мг/кг, практически полностью исчезал из крови через 15 минут.

Данные патоморфологических исследований показали отсутствие патологических изменений внутренних органов кроликов, получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса в течение 6 месяцев.

Таким образом, фенольный гидрофобный препарат прополиса не оказывает токсического влияния на кроликов.

При исследовании хронической токсичности на беспородных собаках в возрасте 6-8 месяцев, изучали действие фенольного гидрофобного препарата прополиса в дозе 100 мг/кг (10 ЕД50), 3 собаки служили контролем.

Исследования показали, что на протяжении всего эксперимента (6 месяцев) состояние животных оставалось хорошим. Все шесть собак были активны, сохраняли хороший аппетит, прибавляли в массе. Поведенческие реакции у животных, которые получали препарат, не изменялись. Дыхание у собак было спокойным, выделений из носа не наблюдалось.

Пульс и у контрольных, и у опытных собак был в пределах нормы. Температура тела собак при пероральном введении препарата прополиса оставалась постоянной и у контрольных, и у опытных животных.

Время свертывания крови у контрольных и опытных собак не различалось, количество эритроцитов – было в пределах нормы. Содержание гемоглобина у опытных животных было выше, чем у контрольных, но с исходом статистически значимых различий не наблюдалось. Подобные результаты были получены и в отношении количества лейкоцитов. Поскольку отсутствовала динамика изменения, показатели находились в пределах нормальных величин, их неоднозначность следует объяснить конституциональными особенностями организма животных.

Лейкоцитарная формула собак, получающих фенольный гидрофобный препарат прополиса, не отличалась от контрольных животных.

Содержание в крови глюкозы, общего белка, мочевины и общих липидов у животных, которые получали фенольный гидрофобный препарат прополиса, находилось на уровне показателей интактных животных. Активность трансаминаз – АлАТ и АсАТ – не повышалась у опытных собак.

Макро- и микроскопические исследования внутренних органов собак не выявили патологических изменений.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии токсичности фенольного гидрофобного препарата прополиса для собак.

Таким образом, исследования, проведенные на трех видах животных, не выявили видовой чувствительности к фенольному гидрофобному препарату прополиса. Отсутствуют также выраженные половые различия в действии препарата на органы и системы.

Выявлено отсутствие токсического действия фенольного гидрофобного препарата прополиса на центральную нервную систему, возбудимость, сократимость и проводимость миокарда, кровотворение, функциональное состояние печени, почек, поджелудочной железы. Отмечалась незначительная индукция ферментов эндоплазматического ретикулума печени, дозозависимая, более выражена у самцов.

Морфологические исследования подтвердили отсутствие токсических эффектов фенольного гидрофобного препарата прополиса на формы и системы крыс, кроликов и собак при введении его в дозах 25, 100 и 250 мг/кг (2,5 ЕД50, 10 ЕД50 и 25 ЕД50) в течение 6 и 12 месяцев.

Таким образом, фенольный гидрофобный препарат прополиса является практически нетоксичным лекарственным веществом.

Аллергизирующие свойства. Фенольный гидрофобный препарат прополиса исследовали в течение 21-днев­ного опыта. Исследования проводили по методу Е.С.Бру­силовского и А.М.Фиалковского (1973) в опытах на морских свинках, как наиболее чувствительном тест-объекте.

Животных опытной группы сенсибилизировали ежедневным введением препарата – перорально, в дозе 10 ЕД50 (100 мг/кг) в течение 7 дней. Затем, на 21-й день опыта, когда организм достаточно сенсибилизирован исследуемым веществом, вводили разрешающую дозу препарата, которая составила суммарную сенсибилизирующую (700 мг/кг).

Известно, что при выраженной антигенной активности изучаемой лекарственной формы введение разрешающей дозы приводит к развитию аллергической реакции. Интенсивность последней зависит от степени сенсибилизации животных. У морских свинок может возникнуть отек (наибольшей степени головы и половых органов), нарушаться координация движений, развиваться бронхоспазм, а в тяжелых случаях – анафилактический шок, который характеризуется судорожной реакцией и коллапсом.

О степени сенсибилизации животных можно также судить по изменению динамики их массы в процессе исследования, изменению ректальной температуры, а также неспецифических (общее количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула) и специфических (реакция специфической агломерации лейкоцитов – РСАЛ) реакций крови.

Подтверждением сенсибилизации является увеличение числа лейкоцитарных агломератов (РСАЛ) в 3 раза в сравнении с исходом. Эта реакция является основным диагностическим методом для выявления по замедленному типу аллергии (И.Е.Сосонкин, 1968).

Период сенсибилизации сопровождается лейкоцитозом, эозинофилией, базофилией (А.Д.Адо, 1970; С.М.Бек­ман, 1974). В то же время, после введения разрешающей дозы происходит уменьшение содержания в крови всех видов лейкоцитов, особенно нейтрофилов и эозинофилов.

Исследования проведены на 12 морских свинках массой 360-570 г. Показатели учитывали в течение опыта трижды: исходный фон, 21 день – до и после введения разрешающей дозы. Контрольная группа животных в течение опыта оставалась интактной.

Результаты исследований показали, что состояние и поведение опытных животных не отличалось от интактных. Так, в течение всего периода наблюдения и в течение 2-х недель после окончания опыта у животных сохранялся хороший аппетит, они были активны, дыхание было ровное, спокойное.

Масса тела как у контрольных, так и у опытных животных возрастала в течение наблюдения на 10-12%, причем разницы в приросте массы у интактных и опытных животных не обнаружено.

Ректальная температура у животных в течение опыта была подвержена колебаниям: 37,4–39°С. Разница в группе опытных и контрольных свинок во все сроки наблюдения не была статистически значимой (Pu>0,05).

Количество лейкоцитарных агломератов в крови морских свинок, получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса и не получавших его, было практически одинаковым, что свидетельствует об отсутствии реакции замедленного типа.

Общее количество лейкоцитов также статистически не отличалось в опытной группе в сравнении с контрольной. Лейкоцитарная формула и у интактных свинок и у животных, получавших фенольный гидрофобный препарат прополиса, была в пределах физиологической нормы. Отсутствовала выраженная эозинофилия и базофилия.

Приведенные данные позволяют сделать заключение об отсутствии выраженной аллергизирующей активности фенольного гидрофобного препарата прополиса.

Изучение возможных мутагенных свойств фенольного гидрофобного препарата прополиса проводили методом учета рецессивных летальных мутаций у дрозофилы.

Целью данного метода является оценка способности исследуемого препарата и продуктов его метаболизма вызывать генные мутации в зародышевых клетках дрозофилы.

Использованный метод Меллер-5 основан на индукции исследуемым препаратом в Х-хромосоме самцов дикого типа рецессивных летальных мутаций, которые через дочерей передаются самцам второго поколения, не доживающим до стадии имаго.

Для определения ЛД50 спиртовый раствор фенольного гидрофобного препарата прополиса (спирт 30% концентрации) добавляли к корму в разведениях 1:15, 1:100, 1:500, 1:1000 и наблюдали за насекомыми в течение 6 суток. Гибели насекомых не отмечали.

Изучение возможных мутагенных свойств проводили, используя разведение спиртового раствора фенольного гидрофобного препарата прополиса в соотношении 1:15 (конечная концентрация этилового спирта в корме не превышала 1%). В качестве контроля использовали корм, содержащий наполнители (спирт) в тех же количествах.

1-2-х суточных самцов подопытной линии Д-32 скрещивали с виргинными самками тестерной линии Меллер-5. После вылета мух первого поколения гетерозиготные самки скрещиваются с самцами Меллер-5. Просмотр культуральных пробирок во втором поколении осуществляли визуально.

Рецессивные леталии оценивали как число культур второго поколения без диких самцов к общему числу культур.

Результаты исследований показали отсутствие статистически значимых отличий опыта от контроля, что означает отсутствие эффекта.

Таким образом, в тесте учета рецессивных летальных мутаций у дрозофилы фенольный гидрофобный препарат прополиса мутагенного эффекта не вызвал.

Изучение кумулятивных свойств фенольного гидрофобного препарата прополиса проводили по методу субхронического теста в нарастающих дозах с прерывистым режимом введения. Исследование было проведено на 40 белых мышах, массой 18-20 г. Первоначальная ежедневная доза составила 10 ЕД50 – 100 мг/кг.

Доза Количество дней введения
100 мг/кг 5 дней
перерыв 2 дня
200 мг/кг 5 дней
перерыв 2 дня
400 мг/кг 5 дней
перерыв 2 дня
800 мг/кг 5 дней
перерыв 2 дня
1600 мг/кг 5 дней
Общая доза – 15500 мг/кг

При проведении изучения кумулятивных свойств фенольного гидрофобного препарата прополиса все животные остались живы.

Таким образом, фенольный гидрофобный препарат прополиса кумулятивными свойствами не обладает.

 

Влияние на иммунную систему

При изучении данного показателя фенольный гидрофобный препарат прополиса вводили белым крысам-самцам массой 160-170 г в дозе 25 мг/кг. Животные самостоятельно поедали препарат в необходимом количестве. При проведении эксперимента крысы были объединены в группы по 8.

Экспериментальные животные были вакцинированы столбнячным анатоксином по 0,5 мл с содержанием 10 ЕС и коревой вакциной в дозе 0,5 мл серии 20, с содержанием в одной дозе вакцины не менее 1000 ТЦД50. Титры специфических антител были изучены при помощи реакции непрямой гемагглютинации со стандартным эритроцитарным диагностикумом серии 78, контроль 1917, а также со стандартным коревым диагностикумом Ленинградского НИИЭМ им. Пастера серии 29, контроль 285. Содержание лизоцима в пробах сыворотки крови определяли по В.Г.Дорофейчуку. Контролем служили животные, не получавшие фенольный гидрофобный препарат прополиса.

При анализе результатов исследований было выявлено, что уже на второй неделе титры к столбняку обнаруживались в контрольной группе 1:60, к 30-му дню – 1:416, на 45-й день – 1:2048 и к концу второго месяца они составили 1:853.

Изучение титров специфических антител к столбняку в опытной группе животных показало, что титр на 15-й день исследования составлял 1:90, к 30-му дню – 1:480, на 45-й день – 1:1920 и на 60-й день – 1:783.

Приведенные показатели свидетельствуют о том, что введение фенольного гидрофобного препарата прополиса не оказывает влияния на формирование специфического иммунитета к столбнячной инфекции.

Анализ содержания специфических коревых антител показал, что в контрольной группе титр антител определялся на низком уровне и на 15-й день опыта был равен 1:5, на 30-й день – 1:33, к 45-му дню – 1:19 и к концу исследования – на 60-й день – титр составил 1:7. У животных опытной группы титр антител на 15-й день был равен 1:5, к 30-му дню – 1:7, к 45-му дню – 1:14 и на 60-й день – 1:17.

Результаты опытов свидетельствовали об отсутствии отрицательного влияния введения фенольного гидрофобного препарата прополиса на формирование специфического противокоревого иммунитета.

Исследование содержания лизоцима в сыворотке экспериментальных животных не выявило статистически достоверного различия у животных опытной и контрольной групп.

Таким образом, проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что фенольный гидрофобный препарат прополиса не оказывает влияние на иммунологическую систему.

Местнораздражающее действие

При проведении экспериментальных исследований по изучению специфической фармакологической активности и токсикологических свойств (острая и хроническая токсичность, аллергизирующее действие препарата и его способность к кумуляции, влияние на плод), при исследовании влияния на иммунную систему организма, местнораздражающего действия фенольного гидрофобного препарата прополиса выявлено не было. Так, мыши, крысы, морские свинки и собаки самостоятельно охотно поедали фенольный гидрофобный препарат прополиса в необходимом количестве в течение всего времени проведения экспериментов: от 24 часов до одного года.

При макроскопическом и микроскопическом исследовании органов желудочно-кишечного тракта экспериментальных животных изменений, свидетельствовавших о проявлении местнораздражающего действия, не отмечали.

При контакте с наружными кожными покровами лиц, работавших как с фенольным гидрофобным препаратом прополиса, так и с лекарственными формами, содержащими его, каких-либо проявлений раздражающего действия не отмечали.

А.И. Тихонов, Т.Г.Ярных, В.П.Черных И.А.Зупанец, С.А.Тихонова. Теория и практика производства лекарственных препаратов прополиса

 

Представленные в данной главе фармакологические исследования субстанций прополиса и их лекарственных форм проводились на кафедре фармакологии Украинской фармацевтической академии (Л.А.Порохняк, Б.А.Рого­жин, 1986), ЦНИЛ УкрФА (Л.В.Яковлева, 1997), КНИРРОИ Украины (В.А.Барабой, 1978), кафедре микробиологии УкрФА (И.Л.Дикий, Л.Ф.Силаева, 1990), ХНИИМИ им. И.И.Мечникова (Л.А.Панченко, 1992), Харьковского медицинского университета (В.Н.Хворостинка, О.А.Ефре­мова, 1991; О.М.Карабан, 1986), Харьковского государственного университета (В.Г.Шахбазов, А.В.Некрасова, 1986), Харьковского института усовершенствования врачей (Е.И.Бодня, 1993).